支原體(Mycoplasma)：目前發(fā)現(xiàn)的最小原核生物，據(jù)統(tǒng)計約15~35% 的細胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細胞的結構與功能，易致實驗結果不穩(wěn)定，須對培養(yǎng)細胞定期進行支原體檢測。

本試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法) 檢測支原體DNA。檢測對象為細胞培養(yǎng)的上清液，細胞沉淀或其他生物制品。該試劑盒具有以下特點：

靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測靈敏度達到10CFU/ml。

       可靠：抽提加入內(nèi)標核酸，全過程質(zhì)量控制。

       穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

       方便：操作簡單，無需電泳步驟。

表1   產(chǎn)品組分

注：

1、陽性質(zhì)控含有支原體DNA和內(nèi)標DNA。

2、內(nèi)部質(zhì)控含有內(nèi)標DNA。

在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意事項和無菌操作規(guī)范！

【操作步驟】

1.樣本制備

    （1）樣本的標準制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個過程需要遵守無菌操作規(guī)范。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄3。直接取20 µL待測樣本DNA，作為模板進行 qPCR 反應。

     （2）前處理陰性樣本準備方案：將RNase Free Water當成樣本，加入內(nèi)部質(zhì)控，進行核酸抽提。

2. qPCR 反應液的準備

       （1）根據(jù)所要檢測樣品的數(shù)量，計算所需反應孔數(shù)，每個樣本做3個重復孔。

     反應孔數(shù)=1個陽性PCR質(zhì)控+1個陰性PCR質(zhì)控+1個前處理陰性質(zhì)控+樣本數(shù)× 3

      （2）根據(jù)反應孔數(shù)計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

     Mix =（反應孔數(shù)+1）×10 μl

      （3）各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準備 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

3. 加樣

      （1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

      （2）向每孔反應管中分裝 10 μL qPCR Mix。

      （3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應管中加入15 ul石蠟油。

      （4）向反應管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

      表 3 加樣示例

【注】：此時每個反應孔的體積為30μL。

       qPCR 陰性的PCR模板為20 ul RNase Free Water。

PCR 儀設置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇TaqMan 探針法：

注：1、該程序為兩階段擴增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數(shù)據(jù)的基礎上加15個Ct值。

   2、ROX設置是以7500為例，但也存在例外，例如StepOne。

【閾值設置】

  以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，如果不能兩階段收集熒光，基線設置1~2個循環(huán)；如果可以，基線設置3-15個循環(huán)。建議用 log 法擴增曲線保證結果穩(wěn)定可靠。

（1） 內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設定：以陽性對照定內(nèi)參擴增曲線閾值，將內(nèi)參的Ct 值定為 28±2。

 （2）支原體(FAM)閾值設定：以陽性對照定支原體擴增曲線閾值，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。

【實驗質(zhì)量控制】

如果陽性對照管的支原體(FAM)Ct 值>30，但陽性對照管及前處理陰性對照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。

如果樣品前處理陰性的內(nèi)參（HEX/VIC)Ct 值>30，陽性對照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值>30 ，表明內(nèi)參DNA存在降解或PCR體系擴增效率下降。

   【結果判讀】

根據(jù)支原體(FAM) Ct 值、內(nèi)標(VIC) Ct 值判定，具體標準如下：

要求每個檢測樣品做3重復，如果3復孔中，兩重復為陽性，則判讀為陽性；建議做樣本前處理陰性，可以質(zhì)控整個抽提過程。

注：檢測結果異常時：

1. 樣品前處理陰性：內(nèi)參Ct值過大，表明抽提效率低；支原體檢測通道Ct值小于37.5，可能前處理抽提過程存在污染。

2. qPCR陰性：支原體和內(nèi)參檢測通道Ct值小于37.5，操作過程存在污染。

3. 樣本前處理陰性質(zhì)控和PCR陽性質(zhì)控內(nèi)參差1±1個Ct值屬于正?，F(xiàn)象。

  【PCR過程注意事項】

由于 PCR 反應非常靈敏，實驗操作中應注意以下事項，以免發(fā)生DNA 污染：

  1．試劑盒開啟后，陽性質(zhì)控和內(nèi)部質(zhì)控與試劑Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蠟油分開存放。

   2．每個組分在使用前都應先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

  3．要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規(guī)范。

  4．建議自備轉運盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉運到加樣超凈工作臺。

  5．建議在 qPCR 反應板上陽性對照的排布應遠離待測樣本和陰性對照。

  6．建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。

  7．建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。

  8．應按照先加陰性，再加樣本，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣。

  9．qPCR 反應板封膜或蓋蓋子時須反復壓緊。

 10．上機擴增前，反應管短時低速離心，將管壁液體收集至管底

 11．蓋上反應管蓋子或者貼上光學膜后，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復摩擦。

 12．本產(chǎn)品僅作科研用途。